RGPU-95 (p-Cl-Phenylpiracetam)

Что такое RGPU-95?

RGPU-95 является структурным аналогом фенилпирацетама, ноотропного соединения, широко известного своими антидепрессантными и анксиолитическими эффектами. Разработка RGPU-95 стала результатом целенаправленного поиска N-карбомаил-метил-4-пара-хлор-фенил-2-пирролидона, который показал, как модификация структуры фенилпирацетама повышает эффективность, специфичность и биодоступность соединения, в то время как случаи побочных эффектов и токсичности уменьшаются. Фенилпирацетам получают из пирацетама путем добавления фенильного кольца в положение 4 2-оксопирролидинового кольца [1].

Первоначально фенилпирацетам был синтезирован в 1983 году Советским Союзом, чтобы помочь космонавтам справляться со стрессом во время космических путешествий. По словам производителя, улучшенная липофильность фенилпирацетама обеспечивает более быстрое и эффективное всасывание. С добавлением фенильного кольца к пирролидиновому кольцу существуют как R-, так и S-изомер фенилпирацетама. При сравнении R-изомера и S-изомера становится ясно, что R-изомер более активен, когда дело касается познания и стимуляции. Однако рацемическая смесь изомеров продается чаще, чем R-изомер в отдельности. Хотя рацемическая смесь успешно повышает когнитивные функции, неясно, есть ли какие-либо существенные стимулирующие преимущества [1].

Основные результаты исследования

1) RGPU-95 вызывает выраженный антидепрессивный и анксиолитический эффект у самцов крыс и, в меньшей степени, у самок крыс.

2) R-фенилпирацетам участвует в нейропротекторной и противовоспалительной активности в моделях воспаления у самцов мышей.

Избранные данные

1) В исследовательском эксперименте, проведенном Тюренковым и соавторами, изучалось, как лечение РГПУ-95 и фенилпирацетамом влияет на тревожно-депрессивное поведение у самцов и самок крыс. В исследование были включены 50 самок и 50 самцов крыс породы Вистар весом от 250 до 280 граммов, которых содержали в стандартных условиях вивария, включая 12-часовой цикл свет/темнота, постоянную комнатную температуру и пищу и воду ad libitum. Все животные, включенные в исследование, были получены из Федерального государственного унитарного предприятия «Питомник лабораторных животных «Рапполово» Российской академии медицинских наук и содержались в соответствии с правилами лабораторной практики в Российской Федерации и Приказом Министерства здравоохранения. Испытуемые прошли тест «открытое поле» для наблюдения за влиянием РГПУ-95 на спонтанное индивидуальное поведение. Анксиолитические свойства обоих соединений измерялись путем помещения испытуемых в классические модели тревожности, такие как вариант Фогеля и тест «приподнятый крестообразный лабиринт». Кроме того, антидепрессивное действие RGPU-95 было исследовано с помощью теста Порсолта на вынужденное плавание, которое обычно используется в качестве модели депрессии, вызванной стрессом [2].

Соединение вводилось как мужчинам, так и женщинам в эквимолярных концентрациях доз 1/10 молекулярной массы. Для RGPU-95 это соответствовало дозе 25 мг/кг. Все вещества, используемые в исследовании, были синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.И. Герцена. 1 мг/кг диазепама и 15 мг/кг мелипрамина также вводились испытуемым в качестве положительных контрольных агентов. Было обнаружено, что RGPU-95 не полностью растворяется в воде, поэтому исследовательская группа разбавляла соединение в 2% крахмальной слизи для создания однородной суспензии. Животные, которым вводили контрольные обработки, также получали раствор крахмальной слизи в эквивалентном объеме, чтобы исключить ошибку, связанную с наличием крахмальной слизи. Испытуемым вводили перорально комбинацию активного лечения и крахмальной слизи или положительный контроль и крахмальную слизь примерно за 60 минут до проведения тестов. Весь статистический анализ был выполнен с использованием непараметрического тестирования, включая U-критерий Манна-Уитни, однофакторный ранговый анализ Краскела-Уоллиса, критерий Дана для множественного статистического сравнения и тесты хи-квадрат [2].

2) RGPU-95 является производным фенилпирацетама и имеет много таких же преимуществ. При этом, в дополнение к его антидепрессивному и противотревожному эффекту, исследовательская группа Звейниеце и др. изучала потенциальные нейропротекторные и противовоспалительные эффекты R-фенилпирацетама. В исследовании использовались 246 мышей ICR в возрасте 8-10 недель и весом 23-25 граммов. Все испытуемые содержались в стандартных условиях и обеспечивались пищей и водой ad libitum при размещении в отдельных клетках. Каждая клетка вентилировалась и содержала подстилку из древесной стружки, материалы для гнездования и деревянные бруски, а также поликарбонатное убежище для мышей в целях обогащения. Дозы R-фенилпирацетама были выбраны на основе результатов первоначального проведенного исследования, которое показало, что дозы соединения в 10 мг/кг и 50 мг/кг имеют потенциал для значительного повышения двигательной активности. Все испытуемые были случайным образом распределены в группу лечения, в то время как исследователи не имели информации о распределении по группам [3].

Концентрации R-фенилпирацетама в мозге и плазме измеряли с помощью ультраэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии. Соединение вводили как внутрибрюшинно, так и перорально испытуемым в дозе 50 мг/кг за 15 минут, 30 минут и 1, 2, 4, 6 и 24 часа до декапитации животных и сбора плазмы и мозговой ткани. Девять групп, состоящих из 4 мышей в каждой, были рандомизированы. Для сбора крови использовались пробирки с гепариновым покрытием, которые подвергались центрифугированию для отделения плазмы. За этой процедурой следовало удаление мозговой ткани; два образца были собраны у каждого животного, поскольку мозг был разделен на правое и левое полушария. Мозговую ткань гомогенизировали с помощью ультразвукового процессора Cole Parmer 130-W. Полученные гомогенаты многократно центрифугировали для получения соответствующих супернатантов, которые затем объединяли и замораживали до тех пор, пока исследовательская группа не была готова к их тщательному анализу. Смесь ацетонитрила и муравьиной кислоты использовалась для подготовки образцов путем депротеинизации с последующим центрифугированием и переносом супернатантов во флаконы UPLC, используемые для масс-спектрометрического анализа [3].

Экспрессию воспалительных генов стимулировали у испытуемых посредством внутрибрюшинной инъекции 20 мг/кг ЛПС. Контрольное лечение или активное лечение R-фенилпирацетамом в дозах 50 мг/кг вводили одновременно с ЛПС с противоположных сторон животных. Кроме того, отек лап испытуемых вызывали посредством интраплантарной инъекции каррагинана. Перед инъекцией всем испытуемым перорально вводили физиологический раствор, R-фенилпирацетам в дозах 10 мг/кг, 25 мг/кг или 50 мг/кг или 10 мг/кг индометацина в течение 7 дней. На 7-й день животные получали лечение примерно за 60 минут до инъекции каррагинана. Каждая группа животных получала либо интраплантарную инъекцию 40 мкл физиологического раствора, либо 40 мкл 2% каррагинана. Значение лапы измерялось с помощью плетизмометра и записывалось до инъекции каррагинана и через 2, 4, 6 и 24 часа после инъекции. При измерении отека лапы исследовательская группа отмечала правую заднюю лапу каждого субъекта, чтобы обеспечить равное погружение в измерительную камеру плетизмометра. Один и тот же экспериментатор всегда измерял одну и ту же группу испытуемых, оставаясь слепым относительно групп лечения.

Электронный анестезиометр фон Фрея использовался для измерения порога отдергивания правой задней лапы в ответ на механический стимул с целью оценки механической аллодинии. В этом эксперименте порог отдергивания определялся как средняя сила в граммах, необходимая для отдергивания стимулированной лапы в течение трех испытаний. Тест проводился через 7 часов после инъекции каррагинана и начинался с помещения мышей на металлический решетчатый пол в индивидуальной камере наблюдения, где им позволяли акклиматизироваться к новой обстановке в течение 10 минут. Нить фон Фрея прикладывалась к поверхности правой задней лапы, и стимул применялся до тех пор, пока не происходило отдергивание, и измерение регистрировалось [3].

Перед началом теста на облизывание лап, вызванное формалином, животные получали перорально либо физиологический раствор, R-фенилпирацетам в дозах 10 и 50 мг/кг, либо дозу 50 мг/кг S-фенилпирацетама в течение 7 дней. На 7-й день испытуемым вводили препараты, а затем через 60 минут делали интраплантарную инъекцию формалина в объеме 30 мкл в правую заднюю лапу. Затем мышей помещали в камеру для наблюдения из плексигласа, в то время как общее время облизывания задней лапы для каждого испытуемого регистрировалось с помощью секундомера. Записанное время затем количественно оценивалось в последующих 5-минутных интервалах в течение 60-минутного периода. Первая фаза теста длилась 5 минут и начиналась с немедленной регистрации времени, потраченного на облизывание, в то время как вторая фаза теста длилась приблизительно 35-40 минут и начиналась через 15-20 минут после инъекции формалина [3].

Обсуждение

1) Результаты теста «открытое поле», через который прошли все испытуемые, испытуемые женского пола контрольной группы показали более высокие показатели как исследовательского, так и локомоторного поведения по сравнению с испытуемыми мужского пола. Также было отмечено заметное увеличение количества актов кратковременного груминга в контрольной группе испытуемых женского пола, что указывает на значительный уровень эмоционального дискомфорта и напряжения. В целом, было показано, что у самок более высокий уровень тревожности, чем у самцов, в то время как RGPU-95 не оказал резкого влияния на исследовательское или локомоторное поведение. Однако было обнаружено, что фенилпирацетам усиливает исследовательское и локомоторное поведение как у самцов, так и у самок крыс в условиях стресса «ситуационной новизны». Более конкретно, исследовательская или ориентационная активность увеличилась больше у испытуемых мужского пола, в то время как локомоторная активность увеличилась больше у испытуемых женского пола при лечении фенилпирацетамом. Важно также отметить, что лечение фенилпирацетамом увеличило количество выходов в центральные зоны, одновременно уменьшив количество кратковременных «тревожных» актов груминга [2].

Женщины-испытуемые в группах положительного контроля продемонстрировали более высокий уровень тревожности, чем мужчины-испытуемые в «приподнятом крестообразном лабиринте». Женщины проводили меньше времени в открытых рукавах лабиринта и заходили в них реже, чем мужчины, что привело к почти полному отсутствию стояния и зависания в открытых рукавах теста. Было показано, что оба экспериментальных лечения, RGPU-95 и фенилпирацетам, показали увеличение количества стояний и выходов в открытые рукава лабиринта, количества времени, проведенного в рукавах, и количества зависаний на открытых рукавах как у мужчин, так и у женщин-испытуемых. Мужчины-испытуемые, которым вводили RGPU-95, испытали более выраженный анксиолитический эффект, чем те, кто получал фенилпирацетам [2].

В дополнение к «приподнятому крестообразному лабиринту» условия конфликта Фогеля показали, что испытуемые женского пола были более восприимчивы к тревожности, основанной на их пищевом и оборонительном поведении. В целом было показано, что самки держались подальше от поильщика в течение более длительных периодов времени, чем самцы, и в конечном итоге делали меньше попыток с низким риском добраться до поильщика. Было обнаружено, что положительное контрольное соединение, диазепам, а также фенилпирацетам и RGPU-95 снижали тревожное поведение у испытуемых животных и имели общий антиконфликтный противотревожный эффект в этой модели как для самцов, так и для самок крыс. RGPU-95, фенилпирацетам и диазепам оказали значительное влияние на латентность подхода у испытуемых женского пола, а также увеличили количество подходов для удовлетворения мотивации к питью у испытуемых мужского пола. Эти наблюдения указывают на большую выраженность анксиолитического эффекта у самцов животных, которые от природы менее склонны к тревожности. В целом было показано, что противотревожное действие RGPU-95 превосходит действие фенилпирацетама, но все же уступает действию диазепама.

Аналогично результатам теста на вызывание тревоги, результаты теста Порсолта на неизбежную силу плавания показали, что испытуемые женского пола в контрольных группах демонстрировали более выраженное депрессивное поведение. Эти результаты были определены по более длительной общей продолжительности иммобилизации, более короткой латентности периода иммобилизации и меньшему количеству прыжков. Было показано, что RGPU-95, а также фенилпирацетам и мелипрамин вызывают значительное увеличение латентного периода иммобилизации, а также уменьшение общего времени иммобилизации как у мужчин, так и у женщин. Эти результаты указывают на антидепрессивную активность соединений. Было показано, что RGPU-95 превосходит фенилпирацетам, вызывая при этом эффекты, аналогичные эффектам мелипрамина [2].

2) Первоначальные результаты исследования, проведенного Звейниеце и др., показали, что R-фенилпирацетам способен проникать через гематоэнцефалический барьер. Соединение обнаруживалось в образце мозговой ткани примерно через 15 минут после однократной пероральной или внутрибрюшинной инъекции. R-фенилпирацетам достигал пиковых концентраций в мозге через 30–60 минут после внутрибрюшинной инъекции и через 60–120 минут после перорального введения. После пероральной и внутрибрюшинной инъекции соединения максимальные концентрации R-фенилпирацетама в тканях мозга составляли 28 мкг/г и 18 мкг/г соответственно. Через 24 часа соединение больше не обнаруживалось в образцах тканей. Что касается образцов плазмы, R-фенилпирацетам обнаруживался через 15 минут после однократной пероральной и внутрибрюшинной инъекции. Максимальная концентрация соединения в плазме была выявлена через 15-30 минут после однократной внутрибрюшинной инъекции и через 60 минут после перорального введения. Эти зарегистрированные времена коррелировали с максимальной концентрацией 45 мкг/мл после внутрибрюшинной инъекции и 24 мкг/мл после перорального введения. Через 24 часа R-фенилпирацетам все еще обнаруживался в плазме на уровне 0,05 мкг/мл как при пероральном, так и при внутрибрюшинном введении [3].

Рисунок 1: A) Концентрация R-фенилпирацетама в образцах мозговой ткани. B) Концентрация R-фенилпирацетама в образцах плазмы.

При изучении противовоспалительных эффектов соединения оценивалась и регистрировалась температура тела во всех группах до и после инъекции ЛПС, вызывающей воспаление. До инъекции температура тела была одинаковой во всех группах, однако через 6 часов после инъекции температура тела экспериментальных групп значительно снизилась по сравнению с температурой субъектов, включенных в контрольную группу. Инъекция ЛПС также была связана со значительным увеличением экспрессии воспалительных генов, таких как ИЛ-1 бета, ФНО-альфа и iNOS, на 75%, 73% и 65% соответственно. Экспрессия воспалительных генов в экспериментальной группе, которой вводили R-фенилпирацетам, существенно не отличалась от экспрессии в контрольной группе. Исследователи посчитали важным отметить, что предварительная обработка S-фенилпирацетамом привела к небольшому снижению экспрессии ИЛ-1 бета и ФНО-альфа по сравнению с экспрессией в контрольной группе ЛПС. Однако экспериментальная группа, получавшая S-фенилпирацетам, имела значительно более высокие уровни экспрессии воспалительных генов, чем испытуемые, получавшие физиологический раствор. Также не было заметной разницы в экспрессии гена iNOS, вызванной ЛПС, у испытуемых, получавших R-фенилпирацетам по сравнению с S-фенилпирацетамом [3].

Рисунок 2: Изменения экспрессии воспалительных генов в ответ на различные экспериментальные методы лечения.

Отек лапы измерялся по увеличению размера лапы из-за воспаления, вызванного интраплантарной инъекцией каррагинана. Было показано, что каррагинан значительно увеличивает случаи отека лапы в зависимости от времени по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор. Эти результаты были подтверждены двухфакторным статистическим анализом с повторными измерениями ANOVA, который показал зависящее от времени ослабление отека, вызванного каррагинаном. При введении в дозах 50 мг/кг было показано, что R-фенилпирацетам значительно уменьшает отек лапы через 2, 4 и 6 часов после инъекции каррагинана на 60%, 40% и 45% соответственно. Дозы соединения 10 мг/кг и 25 мг/кг не уменьшали объем лапы. Было показано, что доза индометацина 10 мг/кг уменьшает отек лапы через 4 и 6 часов после инъекции каррагинана на 36% и 45% соответственно. Эти результаты были подтверждены двусторонним дисперсионным анализом с повторными измерениями, который подтвердил, что введение как R-фенилпирацетама, так и S-фенилпирацетама в дозе 50 мг/кг снижало образование отека в ответ на инъекцию каррагинана.

Рисунок 3: A) Процентное увеличение объема лапы. B) AUC, отображающая увеличение отека лапы.

Результаты также показали, что предварительное лечение субъектов R-фенилпирацетамом позволило значительно уменьшить отек лапы через 2 и 4 часа после инъекции каррагинана примерно на 50%. Предварительное лечение субъектов S-фенилпирацетамом позволило значительно уменьшить отек лапы через 4 часа после инъекции каррагинана примерно на 34%. Наконец, предварительное лечение субъектов индометацином позволило значительно уменьшить отек лапы через 4 и 6 часов после инъекции каррагинана примерно на 37%. Механическая чувствительность определялась с помощью электронного теста с нитью фон Фрея. Было показано, что порог отдергивания значительно снизился через 7 часов после инъекции каррагинана по сравнению с контрольной группой, которой была сделана интраплантарная инъекция физиологического раствора. В целом результаты показали, что пероральное введение 50 мг/кг R-фенилпирацетама и 10 мг/кг индометацина за 60 минут до инъекции каррагинана привело к снижению механической чувствительности на 35% и 40% соответственно [3].

Рисунок 4: Изменения порога механического отнятия в ответ на применение различных экспериментальных методов лечения.

Наконец, тест на облизывание лапы, вызванное формалином, исследовал антиноцицептивные эффекты как R-фенилпирацетама, так и S-фенилпирацетама. Облизывание и встряхивание лапы, в которую был введен формалин, у контрольных испытуемых было вызвано острой, немедленной ноцицептивной реакцией после инъекции формалина. Эта первая фаза длилась 5 минут, в то время как вторая фаза начиналась через 15-20 минут после инъекции формалина и длилась 35-40 минут. Повторный дисперсионный анализ был завершен и подтвердил наличие временного эффекта, но не группового эффекта. Во время второй фазы ноцицептивного поведения исследовательская группа обнаружила, что R-фенилпирацетам способен снижать ноцицептивное поведение, вызванное формалином, дозозависимым образом. Было показано, что доза R-фенилпирацетама 50 мг/кг сокращает продолжительность облизывания лапы примерно на 50%. Введение S-фенилпирацетама не оказало влияния на продолжительность лизания лап ни в первой, ни во второй фазе ноцицептивного поведения. [3]

Рисунок 5: A) Изменения продолжительности лизания лап в первой фазе в ответ на применение различных методов лечения. B) Изменения продолжительности лизания лап во второй фазе в ответ на применение различных методов лечения.

Список источников

[1] Kim S, Park JH, Myung SW, Lho DS. Determination of carphedon in human urine by solid-phase microextraction using capillary gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection. Analyst. 1999 Nov;124(11):1559-62. doi: 10.1039/a906027h. PMID: 10746314.

[2] Tiurenkov IN, Bagmetova VV, Shishkina AV, Berestovitskaia VM, Vasil’eva OS, Ostrogliadov ES. [Gender differences in action Fenotropil and its structural analog–compound RGPU-95 on anxiety-depressive behavior animals]. Eksp Klin Farmakol. 2010 Nov;73(11):10-4. Russian. PMID: 21254591.

[3] Zvejniece L, Zvejniece B, Videja M, Stelfa G, Vavers E, Grinberga S, Svalbe B, Dambrova M. Neuroprotective and anti-inflammatory activity of DAT inhibitor R-phenylpiracetam in experimental models of inflammation in male mice. Inflammopharmacology. 2020 Oct;28(5):1283-1292. doi: 10.1007/s10787-020-00705-7. Epub 2020 Apr 11. PMID: 32279140.